21月齡男童獨自走路不穩(wěn)，易摔跤，雙側(cè)腓腸肌肥大、肌力低下。2歲時通過光學(xué)基因組圖譜技術(shù)識別出系杜氏肌營養(yǎng)不良癥（DMD），實現(xiàn)了這名患兒的“分子診斷”。

近日，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院小兒內(nèi)分泌遺傳代謝科主任醫(yī)師、教授張惠文在《臨床兒科雜志》上發(fā)表的研究文章《利用光學(xué)基因組圖譜技術(shù)診斷杜氏肌營養(yǎng)不良1例報告》（以下簡稱“《報告》”）得出結(jié)論，光學(xué)基因組圖譜技術(shù)能夠成功識別出DMD基因的倒位突變，有望成為該病的補(bǔ)充診斷手段。

該病致病基因是人類最大的基因之一

杜氏肌營養(yǎng)不良（Duchennemusculardystrophy，簡稱“DMD”）是一種X連鎖隱性遺傳的肌營養(yǎng)不良癥，在活產(chǎn)男嬰中的患病率約為1/6000-1/4000，是一種罕見病，女性病例較為罕見。該病的致病基因位于染色體Xp21的抗肌萎縮蛋白基因，有79個外顯子，是人類最大的基因之一。

澎湃新聞此前曾報道，DMD又被稱為“罕見病中的常見病”。患者一般在3至5歲出現(xiàn)癥狀，肌肉萎縮，若不及時干預(yù)治療，通常在12歲前失去行走能力，并在20至30歲左右死于心肺衰竭。國內(nèi)尚無特效藥上市。

前述研究顯示，DMD基因編碼抗肌萎縮蛋白主要分布在骨骼肌和心肌細(xì)胞的細(xì)胞膜上，起支架作用，能保護(hù)肌細(xì)胞膜在肌肉收縮時免遭損傷。DMD基因變異導(dǎo)致抗肌萎縮蛋白功能異常，引起肌細(xì)胞損傷，進(jìn)而出現(xiàn)進(jìn)行性肌肉壞死、萎縮，可導(dǎo)致兩種肌病——貝氏肌營養(yǎng)不良和杜氏肌營養(yǎng)不良，后者較重，主要表現(xiàn)為進(jìn)行性肌無力、發(fā)育遲緩和/或發(fā)育倒退，最終出現(xiàn)呼吸衰竭及心力衰竭等，體格檢查可發(fā)現(xiàn)腓腸肌假性肥大、肌力下降等體征。

目前，在DMD患者中發(fā)現(xiàn)了幾千種不同的DMD基因變異，約60%-70%為片段缺失，5%-15%為片段重復(fù)，另有20%為點突變、小缺失或插入，而倒位突變較為罕見，不足1%。針對片段缺失或重復(fù)檢測的“多重連接依賴性探針擴(kuò)增分析”（multiplexligation-dependentamplification，簡稱“MLPA”）為DMD的主要檢測手段。對于MLPA陰性者，可選擇二代測序技術(shù)，以發(fā)現(xiàn)一些微小變異。

該《報告》通過回顧性分析，對2020年6月在上海新華醫(yī)院兒內(nèi)分泌遺傳科就診的1例DMD病例進(jìn)行研究。該患兒2020年6月12日（7月齡）因肺炎住院治療。當(dāng)時患兒能翻身、能獨坐，無明顯大運動發(fā)育落后，查體未發(fā)現(xiàn)腓腸肌肥大，針對DMD基因的MLPA檢測未發(fā)現(xiàn)缺失/重復(fù)。10月齡時，進(jìn)一步進(jìn)行全外顯子組測序檢測，未檢出相關(guān)基因變異。21月齡時，家長發(fā)現(xiàn)患兒走路不穩(wěn)，容易摔跤。自發(fā)病以來，患兒智力、語言發(fā)育正常。

OGM檢測顯示患兒存在倒位突變

該《報告》內(nèi)容介紹，光學(xué)基因組圖譜（opticalgenomemapping，簡稱“OGM”）是一項基于納米通道的基因作圖技術(shù)，利用基因組中的特定序列位點直接對大分子DNA進(jìn)行熒光標(biāo)記，實現(xiàn)DNA分子的線性光學(xué)成像，在識別基因組的結(jié)構(gòu)變異方面具有獨特優(yōu)勢。OGM可一次性檢出多種不同類型的基因結(jié)構(gòu)突變，包括缺失、易位、倒位、重復(fù)、插入、環(huán)狀染色體、復(fù)雜重排和等臂染色體等。

該患兒在MLPA和全外顯子測序未發(fā)現(xiàn)致病變異后，通過OGM檢測，成功識別出1個臂內(nèi)倒位突變，涉及DMD基因44-55號區(qū)段的12個外顯子，破壞了該基因的正常結(jié)構(gòu)，屬于致病性變異，實現(xiàn)了“分子診斷”。

MLPA可快速且準(zhǔn)確地檢出基因的大片段缺失或重復(fù)變異，故成為DMD患兒的首選檢測手段，但該技術(shù)無法檢出非缺失與重復(fù)的突變。外顯子靶向捕獲二代測序和全外顯子測序是DMD患兒常用的診斷手段。但二代測序?qū)儆诙套x測序，在識別結(jié)構(gòu)突變時存在固有的局限性。此外，目前臨床上常用的方法還有核型分析、熒光原位雜交法等。

但即使綜合上述幾種基因檢測方法，目前仍有約7%的患者找不到致病變異。以往的指南推薦進(jìn)行肌肉活檢以確認(rèn)抗肌萎縮蛋白的表達(dá)情況，但肌肉活檢為有創(chuàng)性檢查，家長接受度低。

與傳統(tǒng)的染色體結(jié)構(gòu)變異的檢測手段相比，OGM具有更高的分辨率，并且能精確提供斷裂位點信息與插入方向。此前，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)OGM能準(zhǔn)確識別出8例DMD患者攜帶的各種結(jié)構(gòu)突變，并能夠提供結(jié)構(gòu)突變的斷裂位點信息。

有研究對來自孤獨癥譜系障礙或智力障礙、先天性畸形、生殖障礙、染色體病和產(chǎn)檢異常的85個樣本進(jìn)行驗證，涉及缺失、重復(fù)、異位、倒位、環(huán)狀染色體和復(fù)雜重排等多種類型的結(jié)構(gòu)突變，結(jié)果發(fā)現(xiàn)OGM對于結(jié)構(gòu)突變的檢測結(jié)果與傳統(tǒng)方法達(dá)到100%的一致性。

OGM除了能發(fā)現(xiàn)DMD患者的致病變異外，還能識別母親攜帶的結(jié)構(gòu)突變，在DMD診斷及攜帶者篩查中具有重要的臨床意義。DMD基因區(qū)域結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性決定了變異的多樣性，因此，DMD的基因診斷需結(jié)合多種檢測方法。而OGM能夠成功識別DMD基因的倒位突變，有望成為DMD患兒的重要補(bǔ)充診斷手段。

此外，OGM技術(shù)也存在一些局限性。其分辨率受限于標(biāo)記密度，故不能檢出較小的突變，也無法檢出斷裂點或融合位點位于人類參考基因組序列的空白區(qū)域的平衡性結(jié)構(gòu)變異。但隨著人類基因組序列的完善，OGM對于這些區(qū)段的結(jié)構(gòu)變異檢測也將逐漸成為可能。