?肝癌是中國第二大致命癌癥，也是全球第三大致死癌癥。在原發(fā)性肝癌中，肝細胞癌（HCC）占所有病例的 80%。肝癌的發(fā)病率和死亡率持續(xù)上升，構(gòu)成了重大的全球公共衛(wèi)生負擔。

由于缺乏特異性的癥狀，大多數(shù) HCC 患者在診斷時已發(fā)展至中期和晚期，可能不再適合進行根治性手術(shù)切除，這實在令人遺憾。因此，在可治愈階段及早發(fā)現(xiàn) HCC 對于有效治療和提高生存率至關(guān)重要。

不幸的是，當前的 HCC 診斷策略，無論是血清甲胎蛋白（AFP）檢測還是超聲檢查，都缺乏足夠的敏感性和特異性，特別是對于早期 HCC。因此迫切需要開發(fā)高度敏感且經(jīng)濟高效的診斷工具，以進一步改善 HCC 患者的預后。

DNA 甲基化異常已被廣泛認可為癌癥生物標志物。在多種腫瘤類型中均發(fā)現(xiàn)導致基因表達失調(diào)的 DNA 甲基化變化，從腫瘤發(fā)生的早期階段到整個進展過程都有涉及。值得關(guān)注的是，肝臟腫瘤中升高的 DNA 甲基化水平始終能將患者與健康對照區(qū)分開來。

基于此，復旦大學附屬中山醫(yī)院樊嘉的研究團隊開發(fā)了一種基于血液 ctDNA 甲基化信號的肝癌早診方法 -HepaAiQ。2024 年 5 月，該研究團隊在 Clinical and Translational Medicine 雜志上發(fā)表了題為 Early detection and prognosis evaluation for hepatocellular carcinoma by circulating tumour DNA methylation: A multicentre cohort study 的論文。論文詳細介紹了這種用于 HCC 早期篩查和預后評估的監(jiān)測工具的構(gòu)建過程和檢測效果。研究結(jié)果表明，HepaAiQ 能準確地區(qū)分肝細胞癌（HCC）患者與慢性乙型肝炎/肝硬化（CHB/LC）患者。更重要的是，HepaAiQ 在巴塞羅那臨床肝癌分期（BCLC 分期）的非常早期（0 期）和早期（A 期）的 HCC 患者中顯示出良好的診斷敏感性。與 AFP 和 DCP 等常用生物標志物相比，HepaAiQ 展現(xiàn)出更高的診斷準確性。此外，HepaAiQ 還有可能成為評估 HCC 患者治療療效和預后的監(jiān)測工具。

研究方法

研究分 3 個階段進行：HCC 標志物的發(fā)現(xiàn)與優(yōu)化、HepaAiQ 模型建立與驗證，以及 HepaAiQ 的臨床應(yīng)用。

第一階段，基于公開可獲得的和內(nèi)部的全基因組甲基化數(shù)據(jù)，選擇 HCC 特異性相關(guān)的 DNA 甲基化標志物，使用額外的組織樣本進行驗證，并優(yōu)化出表現(xiàn)最佳的 20 個標志物，利用這些標志物開發(fā)基于血液的多位點定量甲基化特異性 PCR（qMSP）檢測——HepaAiQ。

第二階段，在 559 名患者中建立針對早期 HCC 檢測的 HepaAiQ 模型，并在一個包含 523 名患者的隊列中進行驗證。

第三階段，將 HepaAiQ 檢測方法與現(xiàn)有血清檢測方法進行比較；在早期肝癌的獨立測試集中應(yīng)用 HepaAiQ 模型；利用該檢測方法對 HCC 患者的預后進行評估。

研究設(shè)計

研究結(jié)果

1、HCC 標志物的發(fā)現(xiàn)與優(yōu)化

利用簡化甲基化測序（RRBS）方法和 TCGA 數(shù)據(jù)庫獲得樣本甲基化數(shù)據(jù)，通過 HCC 腫瘤組織與瘤周組織或健康血漿的三次獨立比較，采用P值、甲基化百分位數(shù)和GC富集程度對 HCC 組織中高度代表性的差異甲基化區(qū)域（DRMs）進行排序，以濾除背景噪聲較高的標志物，最后確定了 183 個常見的高甲基化 DRMs。接著用 qMSP 篩選并驗證 20 個最有效的標志物，將其納入多位點 qMSP 分析。

2、構(gòu)建并驗證 HepaAiQ 模型

為了構(gòu)建用于 HCC 診斷的 HepaAiQ 模型，訓練集納入了一個來自多中心的隊列，包含 293 名 HCC 患者、96 名慢性乙型肝炎/肝硬化（CHB/LC）患者、23 名良性肝?。˙HL）患者以及 147 名健康對照（HCs）。其中，巴塞羅那臨床肝癌（BCLC）分期0/A期（中國肝癌分期I期）的 HCC 患者比例高達 76.5%。所有 559 份血漿樣本均采用了 HepaAiQ 檢測法進行處理。訓練集中所得 HepaAiQ 模型的 AUC（ROC 曲線下面積）為 0.944。

在訓練集中，HepaAiQ 模型對 HCC 的敏感性為 86.0%，慢性乙型肝炎/肝硬化（CHB/LC）、良性肝病（BHL）和健康對照（HCs）的特異性分別為 90.6%、100% 和 91.8%。

驗證集納入了 523 名患者，其中 205 名肝細胞癌（HCC）患者，100 名慢性乙型肝炎/肝硬化（CHB/LC），102 名良性肝?。˙HL），116 名健康對照（HCs）。在此隊列中，81.5% 的 HCC 患者處于早期階段（BCLC 分期 0/A 或 CNLC 分期 I）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所得 HepaAiQ 模型的 AUC（ROC 曲線下面積）為 0.940，對 HCC 的敏感性為 84.4%，對 CHB/LC、BHL 和 HC 的特異性分別為 88.0%、92.2% 和 90.5%。

值得注意的是，HepaAiQ 模型在訓練/驗證集中對于早期 HCC 的敏感性分別為 83.0% / 80.8%；對于小于 2 厘米的腫瘤的敏感性分別為 75.6% / 77.8%；對于單個腫瘤的敏感性分別達到 83.9% / 82.9%。這些發(fā)現(xiàn)均表明 HepaAiQ 模型在 HCC 早期檢測和鑒別診斷方面具有較大的應(yīng)用潛力。

3、HepaAiQ 模型與傳統(tǒng)生物標志物 AFP 和 DCP 的比較

研究人員進一步研究 HepaAiQ 檢測法是否在現(xiàn)有的診斷 HCC 的血液檢測中展現(xiàn)出更大的臨床優(yōu)勢。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在同時接受了 HepaAiQ 檢測和 AFP 檢測的 489 名 HCC 患者中，HepaAiQ 檢測法展現(xiàn)出更優(yōu)的診斷性能，其對 HCC 的敏感性為 85.3%，顯著高于 AFP(55%)。而在 247 名對照中兩者顯示出相當?shù)奶禺愋裕?0.3% VS 88.7%）。重要的是，在 189 名 AFP 檢測陰性的早期 HCC 患者中，HepaAiQ 檢測法敏感性達到 75.1%。

HepaAiQ 和 AFP 在檢測 HCC 中的性能比較。在 489 名 HCC 患者中，HepaAiQ 模型的敏感性在各癌癥階段均顯著高于 AFP。

同樣地，對 441 名患者使用了另一種 HCC 血液檢測方法 DCP 進行了檢測。在 232 名 HCC 樣本和 209 名對照中觀察到了 HepaAiQ 優(yōu)于 DCP 的表現(xiàn)。值得注意的是，在 56 名 DCP 檢測陰性的早期 HCC 患者中，HepaAiQ 發(fā)現(xiàn)了 44 名陽性患者（即敏感性為 78.6%）。

這些結(jié)果表明，相比于傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)標志物，甲基化標志物能更準確地捕捉到 HCC 信號，能提高臨床監(jiān)測的有效性。

4、HepaAiQ 區(qū)分高危人群早期 HCC 的獨立測試

超聲檢查結(jié)合 AFP 常用于高危人群的 HCC 篩查，為了模擬 HepaAiQ 的實際應(yīng)用效果，研究納入了 189 名慢性肝病患者，這些患者要么患有 HCC，要么沒有 HCC。

與 AFP 在同一組別的敏感性為 58.5%，和特異性為 92.7% 相比，HepaAiQ 對高風險人群中早期 HCC 的敏感性為 70.8%，特異性為 89.5%。雖然隊列規(guī)模有限，但 HepaAiQ 顯示出了在高危人群中進行 HCC 監(jiān)測的應(yīng)用潛力。

5、經(jīng)歷過手術(shù)切除的 HCC 患者中 HepaAiQ 模型的預后意義

接下來，研究團隊在 103 名經(jīng)歷過切除手術(shù)的 HCC 患者中探索了 HepaAiQ 模型在預后評估中的潛在用途。在這組患者中，有 47 例在術(shù)后隨訪期間被確認出現(xiàn)腫瘤復發(fā)，而 56 例未表現(xiàn)出復發(fā)跡象。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HepaAiQ 檢測的 ctDNA 甲基化水平在 HCC 患者腫瘤切除后一個月顯著下降，陽性率從 78.6%（81/103）降至 33.0%（34/103）。進一步分析顯示，術(shù)后復發(fā)的患者在術(shù)后 HepaAiQ 檢測中的陽性率高于無復發(fā)的患者。Kaplan-Meier 生存分析表明，術(shù)后 ctDNA 陽性的患者比陰性患者的預后較差（HR，3.33）。單因素和多因素分析均證實術(shù)后 HepaAiQ 狀態(tài)是預測術(shù)后復發(fā)的獨立指標。

結(jié)論

研究開發(fā)并驗證了一種新型的基于血液 ctDNA 甲基化信號，用于 HCC 鑒別診斷和預后評估的監(jiān)測方法——HepaAiQ。且與 AFP 和 DCP 等常用生物標志物相比，HepaAiQ 展現(xiàn)出更高的診斷準確性。HepaAiQ 有望成為一種具有成本效益和簡單的 HCC 篩查工具，用于人群水平的 HCC 篩查及患者預后的管理。

參考文獻：

[1] Guo DZ, Huang A, Wang YC, Zhou S, Wang H, Xing XL, Zhang SY, Cheng JW, Xie KH, Yang QC, Ma CC, Li Q, Chen Y, Su ZX, Fan J, Liu R, Liu XL, Zhou J, Yang XR. Early detection and prognosis evaluation for hepatocellular carcinoma by circulating tumour DNA methylation: A multicentre cohort study. Clin Transl Med. 2024 May;14(5):e1652. doi: 10.1002/ctm2.1652IF:10.6. PMID: 38741204；PMCID: PMC11091019.