全球首對體細胞克隆猴“中中”（左）和“華華” （右）。中國科學(xué)院腦科學(xué)與智能技術(shù)卓越創(chuàng)新中心供圖

【編者按】在上海市科學(xué)技術(shù)委員會資助（項目編號：22DZ2304300）下，澎湃新聞聯(lián)合《世界科學(xué)》對獲得國家及上海市科技獎勵的成果進行科普化報道。 

本篇報道圍繞2022年度上海市自然科學(xué)一等獎項目“ 非人靈長類模式動物構(gòu)建”展開。該研究由中國科學(xué)院腦科學(xué)與智能技術(shù)卓越創(chuàng)新中心研究員孫強、劉真、仇子龍、張洪鈞完成。

“拔一根毫毛，吹出猴萬個！”《西游記》中孫悟空的這一能力生動展示了什么是“克隆”。

克隆，可以通俗地被理解成“拷貝”，“像是復(fù)印出來”一個或一個個完全相同的個體、單元。

而這與“龍生九子”截然不同：克隆，跳過了兩性生殖過程，也跳過了前者可能發(fā)生的遺傳物質(zhì)的“組合”或變異。

2017年年底，一個世界級成果：全球首例體細胞克隆猴，在中國誕生。相關(guān)論文隨后于2018年1月25日在國際學(xué)術(shù)期刊《細胞》（Cell）上在線發(fā)表。這一消息當(dāng)時就引爆了整個學(xué)術(shù)圈和科研界。

此前，全球科學(xué)家經(jīng)過數(shù)十年的努力，但一直未能攻克非人靈長類動物體細胞克隆的難題。

直到兩只體細胞克隆猴“中中”“華華”誕生在中國科學(xué)家手中。

這一技術(shù)的突破，意味著人類可以借助克隆猴技術(shù)，揭開更多生命科學(xué)的奧秘，比如靈長類的發(fā)育、大腦以及多種疾病相關(guān)難題。

但即便到了今天，克隆猴技術(shù)依然存在瓶頸，成功率依舊不高。

近日，中國科學(xué)院腦科學(xué)與智能技術(shù)卓越創(chuàng)新中心非人靈長類研究平臺研究員孫強接受了記者的專訪。

“我們做克隆猴，目的是更好地構(gòu)建非人靈長類模式動物?！睂O強說，“模式動物”的“模式”是什么？就是像用一個模子刻出來的。

為什么需要克隆猴？

在克隆猴誕生前，猴子也被用于轉(zhuǎn)基因或藥物測試等研究。但這些猴子都是由受精卵發(fā)育來的。

“但它有一個問題就是，它們的基因型是不同的，各個猴子之間的遺傳背景不同?！睂O強表示。

“再舉個例子，比如說用考試去篩選一群學(xué)生，我們要給這些學(xué)生同樣的考卷，對不對？否則100個人參加考試，有100張不同的考卷，你怎么評價誰的水平高，誰的水平低？我們篩藥也是一樣。你這個藥好不好，你得用同樣的‘試卷’評價。這樣才能減少樣本間的誤差。這時候，藥就是這些‘考生’，猴子就是這些‘考卷’。篩藥時使用的猴模型，比如說基因編輯和轉(zhuǎn)基因的猴，如果它們的基因型有不同，致病基因可能在表達水平上有差異，遺傳背景有影響，那么就把這個問題復(fù)雜化了?？寺〖夹g(shù)正好可以解決這一難題，讓它們遺傳背景又一致，基因型又一致。這樣就能夠讓它真正變成模式動物。所謂模式是什么？就是用一個模子刻出來的?！?

克隆猴提供了幾乎完美的模型。猴是靈長類，是生命演化中最接近人的動物。

“比如，如果我有一批A基因突變的猴子，其他所有背景都一樣，只是A基因有差異，如果跟對照相比，一個藥物能夠緩解A基因突變導(dǎo)致的癥狀，那么就可以確認這個藥是對的?！睂O強說。

除了測試藥物，基于這一幾乎完美的動物模型，人們可以進行新藥的研發(fā)，以及探索生命科學(xué)更多未知的疆域。

其實，“克隆”無處不在。植物的無性繁殖，比如插條、嫁接、落葉生根等，都是“克隆”。

人類也在很早就開始嘗試克隆各種動物。但非人靈長類動物，比如猴子的克隆始終是個難題。

早在20世紀(jì)初，德國動物學(xué)家、實驗胚胎學(xué)先驅(qū)漢斯·斯佩曼（Hans Spemann）已經(jīng)使用胚胎分裂技術(shù)克隆出了蠑螈。

胚胎分割技術(shù)作為早期探索階段的技術(shù)，當(dāng)然是不完美的，它的效率很低，因而沒有成為動物克隆領(lǐng)域的主要方向。孫強表示，“你可能在二細胞期或四細胞期分割，你最多也就分離出4個細胞。假如全部都變成個體，最多也就變成4個個體。但實際上，四細胞期有時候也就出生存活一個或者兩個，所以說目前胚胎級克隆的克隆數(shù)有限。而體細胞克隆，理論上是無限的?！?

所以，現(xiàn)代的動物克隆技術(shù)的主流是“核移植”，尤其是體細胞核移植——給卵母細胞（卵細胞）換一個細胞核。因為胚胎細胞在數(shù)量上的局限性，體細胞是更好的核來源。結(jié)果就是，一個細胞核，對應(yīng)著克隆后代的一個小生命。

1928年，斯佩曼嘗試將蠑螈胚胎細胞核轉(zhuǎn)移到卵細胞中，雖然最終沒有克隆成功，卻是“移核”的首次實踐。

1962年，英國牛津大學(xué)的科學(xué)家約翰·戈登（John Gurdon）將非洲爪蟾腸上皮細胞的細胞核移植到蛙卵細胞里，并培養(yǎng)出蝌蚪。其實驗成功率只有2%。

1996年，克隆羊多利誕生。277次核移植，只產(chǎn)生29個胚胎，最后有且只有多利幸運地出生了，這個成功率比非洲爪蟾的2%還低。但多利的誕生，打破了“哺乳動物體細胞無法分化”的成見。

隨后，豬、牛、狗等動物的體細胞核移植克隆都被實現(xiàn)。

但克隆猴一直“胎死腹中”。

克隆猴不是僅僅為了克隆猴?？寺『镎Q生之初，研究團隊負責(zé)人蒲慕明院士說：制備克隆猴不是為了獵奇，更不是為了克隆人，而是為了建立非人靈長類疾病動物模型，為研究人類疾病機制和藥物研發(fā)帶來希望。

中國科學(xué)院腦科學(xué)與智能技術(shù)卓越創(chuàng)新中心非人靈長類研究平臺研究員孫強。

愚公“移核”與克隆猴的瓶頸

在體外人工構(gòu)建一個生命體，何其難？

生命的繁衍過程太復(fù)雜了。

“挑戰(zhàn)太多了！”孫強說，“不用說培養(yǎng)一只猴子，就是從胚胎，不依賴任何母體，直接培養(yǎng)出一只老鼠，那都是非常震撼的事情，意味著（哺乳動物）生命可以在體外培育了，那是真正的試管了?！?

他表示，“目前，早期胚胎的所有發(fā)育還沒完全搞清楚，子宮是怎么保證胎兒營養(yǎng)的，器官在子宮內(nèi)是怎么分化的，什么誘導(dǎo)了器官的對稱發(fā)育……沒有回答的問題太多了?！薄半x開子宮還做不到，你怎么模擬一個子宮的環(huán)境？早產(chǎn)兒，畢竟在母體里懷孕到150天或者更長時間，接近出生，各個器官都發(fā)育完成了，但是要真正變成從一個受精卵一個細胞開始完全培養(yǎng)、發(fā)育長出來很難。如果那個能做出來，遠比克隆要震撼得多！”

所以，現(xiàn)在要克隆猴，還是要“借腹”：依靠卵母細胞，構(gòu)建一個重組細胞，激活，移植到代孕猴的子宮內(nèi)，然后待產(chǎn)。

孫強介紹，2003年，美國匹茲堡大學(xué)教授杰拉爾德·沙滕（Gerald Schatten）依靠美國俄勒岡靈長類中心，曾經(jīng)一次性做了700多個卵，然后移植到30多只猴子體內(nèi)，最后都沒生，他當(dāng)時很失望。俄勒岡靈長類中心的另一位教授舒克拉特·米塔利波夫(Shoukhrat Mitalipov)覺得這可能是技術(shù)問題。2007年，他接受一個雜志的采訪，說他已經(jīng)用了15000枚卵來做克隆猴。到2010年的時候，他發(fā)了一篇論文，就是把克隆胚胎移到10只猴子體內(nèi)，但是只有1只懷孕，而且懷孕到81天，這個猴子流產(chǎn)了。

“我們總共用了接近五年時間去解決這些問題，前邊都是失敗、失敗、失敗，最大的失敗出現(xiàn)在2017年的8月。”“8月的時候，我們就得到了兩只克隆猴，一只在140多天的時候生出來，活了三個小時，沒有肺呼吸，死掉了；另一只活了30個小時也死掉了。那個時候我們的失望達到了極點，就像買彩票，彩票中獎號碼是10個，第1個號碼到第9個號碼都是對的，然后到第10個號碼突然錯了。”

他們從失敗中走出來，2017年年底，終于成功做出了全球首例體細胞克隆猴。

孫強介紹，“實際上，因為體細胞很小。猴子的卵母細胞直徑110微米，很大，體細胞直徑大概就十幾個微米。我們沒有取核，它帶的細胞器和線粒體也很少。我們是直接把整個體細胞融合進去了。我們檢測過，‘華華’細胞中來自供體猴體細胞的線粒體接近20%，‘中中’的大約不到3%?！?

“現(xiàn)在的問題是，其實克隆的效率還是很低的。猴子體細胞的表觀重建的機制，以及早期胚胎的表觀遺傳學(xué)變化還不清楚。我覺得，最主要（工作）的首先是，把猴子的表觀遺傳學(xué)機制解析清楚。在此基礎(chǔ)上，真正提升體細胞克隆的效率，希望能把現(xiàn)在大概3%左右的水平，提升到10%或以上?！?

孫強說，“在2024年年初，我們發(fā)了一篇文章，在克隆恒河猴時，我們解決了胎盤的發(fā)育問題，通過滋養(yǎng)層細胞置換，把克隆胚胎移植出生效率從2%提升到9%左右，提升到了四倍多。”

孫強表示，克隆不是一個自然發(fā)育的過程，要打破很多障礙。通過這個克隆過程中，人們可以了解胚胎早期發(fā)育的，尤其表觀遺傳學(xué)層面的生物學(xué)機制，這也是對生命的認識。

目前，孫強團隊正在用多組學(xué)和測序的方法來分析，細胞基礎(chǔ)表觀的變化是什么樣的，克隆時什么樣，來觀察各種調(diào)控過程的振蕩。

科研三階段：試管猴、轉(zhuǎn)基因猴、克隆猴……

“有人跟我聯(lián)系，說他養(yǎng)的寵物狗不行了，能不能把它克隆出來。國內(nèi)有公司在做。我做的是克隆猴，不會做克隆狗。”孫強說。

在一次演講中，孫強提到他研究歷程中的三個階段：試管猴、轉(zhuǎn)基因猴、克隆猴……

他說，在云南省的西雙版納州瀾滄江畔的一座山上，他工作了4年，一直待到2008年。

那是一個973國家重點研發(fā)項目，他接手的時候，項目已經(jīng)執(zhí)行了一半。因為2001年轉(zhuǎn)基因猴技術(shù)體系已經(jīng)建立了，所以項目的目標(biāo)是希望做出轉(zhuǎn)基因猴。他是半途去的，目標(biāo)是至少要做出試管猴，如果能做出轉(zhuǎn)基因猴更好。

他記得非常清楚，2007年立春的2月4日當(dāng)天，他們就做出了中國第一只試管猴，之后又做了十幾只猴子，但是很遺憾，沒有一只是轉(zhuǎn)基因陽性的。項目結(jié)束以后，由于沒有資金的支持，他從山上撤了回來。

回來以后，在上海待了半年多。很幸運，一個機會出現(xiàn)了。中國科學(xué)院神經(jīng)所的蒲慕明先生找到他，讓他繼續(xù)做猴子。

這次是蘇州太湖的西山島，上面有一個很大的猴場，1萬多只猴子，他就到島上去陪猴子了。

在孫強的講述里，工作人員要做的一件事情是要看猴子的月經(jīng)。島上的實驗室大概有幾百只猴子，每天都要看猴子的月經(jīng)。每次猴子“超排卵”都要打針，從月經(jīng)來的第一天開始，一般要打12天，一天打2針。

孫強介紹，小白鼠連續(xù)20代近交，得到近交系，遺傳背景是一致的。小鼠的繁殖周期大概是半年，連續(xù)20代也就頂多10年時間，這件事在上個世紀(jì)初就做完了。但猴子的繁殖周期、性成熟時間、傳代時間要5年，做20代就要100年，“沒人能做得成”。

這就是人們?yōu)槭裁葱枰寺『铮阂^近交，要縮短這100年。

在世界首個體細胞克隆猴成果新聞發(fā)布會上的報告中，孫強表示，體細胞克隆總結(jié)下來有四個節(jié)點：構(gòu)建胚胎、激活胚胎、啟動核基因組、著床后發(fā)育。除了最后一個節(jié)點無法控制，前三個節(jié)點都可以干預(yù)。只不過，每一個節(jié)點都是一座“大山”。

起初，團隊里其他成員都是獸醫(yī)，包括取卵在內(nèi)的大部分精密實驗操作都由孫強一人承擔(dān)。

據(jù)中國科學(xué)報報道，即使在2010年國慶假期，孫強在雨夜騎車出車禍、鎖骨骨折，他也忍著劇痛花十天做完原定的取卵實驗才住院手術(shù)。絕大多數(shù)時候，大多數(shù)目標(biāo)都不值得以健康為代價的投入，但在該項卓絕的研究面前，孫強認為他必須這么做。

幸運的是，研究生劉真在2010年加入孫強團隊，次年開始在島上生活，并很快成長為骨干。

據(jù)媒體公開報道，劉真花了兩年時間練習(xí)并優(yōu)化構(gòu)建胚胎的流程。他剛開始是在小鼠卵母細胞上練習(xí)，每天練習(xí)8到10個小時，差不多連續(xù)練習(xí)了三四個月。后來，他又轉(zhuǎn)到難度更大的猴子細胞上練習(xí)——眼睛看著顯微鏡，兩只手操作，腳也有操縱任務(wù)。手腳并用練到2014年底，劉真的相關(guān)實驗操作技術(shù)爐火純青，去一個細胞核平均只需要10秒鐘，而注入同樣用時甚短。目前，除了劉真，中國科學(xué)院腦科學(xué)與智能技術(shù)卓越創(chuàng)新中心非人靈長類研究平臺已經(jīng)擁有一支能夠熟練進行體細胞核移植的隊伍。

孫強表示，只有精湛的技術(shù)，才能保證對卵母細胞損傷最小。

為了提高激活胚胎的成功率，孫強團隊還嘗試了多種激活條件，一開始使用只有13%囊胚率的離子霉素+6-DMAP，后來使用組蛋白乙?；敢种苿┨幚?，囊胚率提高到16%。借鑒一篇2014年發(fā)表的論文中的研究方法，他們用H3K9me3去甲基化酶Kdm4處理，囊胚率提高到45%。

孫強團隊還嘗試了不同來源的體細胞來構(gòu)建胚胎。最后，他們發(fā)現(xiàn)成纖維細胞是最好的選擇。也正是用成纖維細胞核，他們成功克隆出了“中中”和“華華”。

孫強表示，“追求真理，保持好奇心?！笨寺『铩爸兄小薄叭A華”只是個起點，他希望，在這個基礎(chǔ)上能做出更好的非人靈長類模式動物。“我還要感謝一下我的家人，因為這些年，跟猴子在一起的時間，比跟他們在一起的時間都多?！?/p>